کیت MTT

کیت MTT روشی ساده‌ترین و ارزان قیمت جهت بررسی تکثیر و امکان حیات سلول میباشد. این ویژگی ها سبب تبدیل MTT به روشی کارآمد و پراستفاده جهت سنجش توان القا یا مهار تکثیر داروها، سایتوکاین‌ها، فاکتورهای رشد، میتوژن‌ها و دیگر تیمارها گشته است. کیت میتوسیب دارای محلول یا پودر MTT و DMSO میباشد که در سه حجم جهت انجام آزمایش در ۱، ۳ و ۱۰ پلیت ۹۶ خانه طراحی گشته است.

کیت MTT

کیت MTT روشی ساده‌تر و ارزان قیمت جهت بررسی تکثیر و امکان حیات سلول می‌باشد. این ویژگی‌ها سبب تبدیل MTT به روشی کارآمد و پراستفاده جهت سنجش توان القا یا مهار تکثیر داروها، سایتوکاین‌ها، فاکتورهای رشد، میتوژن‌ها و دیگر تیمارها گشته است. کیت MTT یک ابزار آزمایشگاهی پرکاربرد در زیست‌شناسی سلولی است که برای اندازه‌گیری میزان تکثیر و زنده‌مانی سلول‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این کیت بر اساس اصل احیای رنگ تترازولیوم (MTT) توسط سلول‌های زنده عمل می‌کند.

اصول کار کیت MTT

• MTT: یک نمک تترازولیوم زرد رنگ است که به صورت محلول در آب می‌باشد.
• سلول‌های زنده: آنزیم‌های دهیدروژناز موجود در میتوکندری سلول‌های زنده، MTT را به فرمازان کریستالی بنفش رنگ تبدیل می‌کنند.
• تشکیل فرمازان: میزان تشکیل فرمازان به طور مستقیم با تعداد سلول‌های زنده و فعالیت متابولیکی آن‌ها متناسب است.
• اندازه‌گیری: با استفاده از اسپکتروفتومتر، میزان جذب نوری در طول موج مشخصی (معمولاً 570 نانومتر) اندازه‌گیری می‌شود. این جذب نوری با تعداد سلول‌های زنده متناسب است.

کاربرد های کیت سنجش MTT

سنجش MTT جهت بررسی میزان فعالیت متابولیکی سلول‌ها در نقش مشخصه زنده ماندن، تکثیر و سمیت سلولی مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش رنگ‌سنجی طبق احیای نمک زرد تترازولیوم (3-(4،5-دی متیل تیازول-2-یل)-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید یا MTT) به کریستال‌های فورمازان با رنگ بنفش بوسیله سلول‌های فعال متابولیکی می‌باشد. سلول‌های زنده دارای آنزیم‌های اکسیدوردوکتاز وابسته به NAD (P) H می‌باشند که MTT را به فرمازان می‌کاهد.

• سنجش سمیت سلولی: برای تعیین اثرات سمی مواد شیمیایی، داروها، یا عوامل محیطی بر روی سلول‌ها.
• بررسی اثرات رشد سلولی: برای ارزیابی تأثیر فاکتورهای رشد، هورمون‌ها، یا سایر عوامل بر روی تکثیر سلولی.
• غربالگری دارو: برای شناسایی ترکیبات دارویی جدید با پتانسیل ضد توموری.
• بررسی اثرات ژن‌ها: برای مطالعه نقش ژن‌های خاص در رشد و تکثیر سلولی.
• بهینه‌سازی شرایط کشت سلولی: برای تعیین شرایط بهینه کشت سلول‌های مختلف.

محلول بنفش چگونه ایجاد می‌شود؟

با حل نمودن کریستال‌های نامحلول فرمازان در حلال DMSO، محلول بنفشی بدست می‌آید که شدت رنگ آن با مقدار فعالیت سلول و در نهایت تعداد سلول‌ها دارای ارتباط خطی می‌باشد. میزان جذب بوسیله الایزا ریدر در بازه ۵۰۰ تا ۶۰۰ نانومتر به سنجش می‌رسد. هر چقدر رنگ محلول تیره‌تر باشد، تعداد سلول‌های زنده و فعال متابولیک بالاتر می‌باشد.

نمونه هایی از کاربرد های سنجش MTT

• کمی‌سازی رشد و زنده‌مانی سلولی
• بررسی میزان تکثیر و شمارش سلول در پاسخ به فاکتورهای رشد، سایتوکاین‌ها و مواد مغذی
• اندازه‌ گیری سمیت سلولی ناشی از تیمار با انواع داروها، مواد سمی یا مهارکننده رشد

طریقه استفاده از کیت MTT

1.  بنابر سلول و سبک پژوهش خود تعداد مناسبی سلول را درون چاهک‌های پلیت ۹۶ خانه ریخته و پلیت را ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد در انکوباتور (۵٪ CO2) گرماگذاری نمایید.
2. محیط کشت مدنظر را با محیط دارای تیمارهای مورد نظر جایگزین کرده و به مدت ۲۴ تا ۷۲ ساعت گرماگذاری نمایید (بنابر نوع پژوهش خود). اگر علاوه بر سلول‌های درحال تیمار، سلول‌های تیمار نشده و چاهک بدون سلول هم درنقش کنترل داشته باشید نتایج بهتری بدست خواهید آورد.
3. محلول MTT را از فریزر خارج نموده و صبر کنید به دمای محیط برسد. ۱۰μl محلول ۵mg/ml به هر چاهک اضافه نمایید. پلیت‌ها را ۴ تا ۶ ساعت در انکوباتور جاگذاری نمایید.
4. مایع رویی را به آهستگی و کاملا تخلیه نمایید و ۱۰۰μl از DMSO درون هر چاهک بریزید.

مزایای کیت MTT در آزمایشگاه‌ ها

کیت MTT یکی از ابزارهای پرکاربرد در آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی سلولی است که برای سنجش زنده‌مانی و تکثیر سلولی به کار می‌رود. این کیت به دلیل سادگی، سرعت و دقت بالا، مزایای بسیاری نسبت به سایر روش‌ها دارد. در زیر به برخی از مهم‌ترین مزایای کیت MTT اشاره شده است:

• سادگی روش: استفاده از کیت MTT بسیار ساده بوده و نیاز به تجهیزات پیچیده ندارد.
• سرعت بالا: نتایج آزمایش با استفاده از کیت MTT در مدت زمان کوتاهی قابل دستیابی است.
• حساسیت بالا: این کیت قادر به تشخیص تغییرات جزئی در تعداد سلول‌ها و فعالیت متابولیکی آن‌ها است.
• تکرارپذیری بالا: نتایج حاصل از استفاده از کیت MTT بسیار قابل اعتماد و تکرارپذیر هستند.
• هزینه مناسب: قیمت کیت MTT نسبت به سایر روش‌های سنجش زنده‌مانی سلولی مقرون به صرفه‌تر است.
• عدم نیاز به شمارش مستقیم سلول‌ها: با استفاده از کیت MTT نیازی به شمارش مستقیم سلول‌ها نیست و می‌توان به طور غیرمستقیم به میزان زنده‌مانی و تکثیر سلولی پی برد.
• کاربرد گسترده: کیت MTT در طیف وسیعی از مطالعات سلولی، از جمله بررسی سمیت داروها، ارزیابی اثر فاکتورهای رشد و مطالعه فرآیندهای آپوپتوز، کاربرد دارد.

محدودیت‌ های کیت MTT

• تأثیر عوامل خارجی: عوامل مختلفی مانند pH محیط کشت، غلظت MTT، زمان انکوباسیون و نوع سلول می‌توانند بر نتایج آزمایش تأثیر بگذارند.
• اندازه‌گیری کلی: این روش تنها میزان کلی سلول‌های زنده را اندازه‌گیری می‌کند و اطلاعاتی در مورد نوع مرگ سلولی (نوکروز یا آپوپتوز) ارائه نمی‌دهد.
• تداخل با برخی ترکیبات: برخی ترکیبات می‌توانند با واکنش MTT تداخل کرده و نتایج کاذب ایجاد کنند.

در کل، کیت MTT یک ابزار ارزشمند برای پژوهشگران در زمینه‌های مختلف زیست‌شناسی سلولی است. با در نظر گرفتن محدودیت‌های این روش و رعایت دقیق پروتکل‌های آزمایشگاهی، می‌توان از آن برای کسب اطلاعات دقیق و قابل اطمینان در مورد رشد و زنده‌مانی سلول‌ها استفاده کرد.